УДК 616.37−053.9:615.27
С. И. Тарновская, В. В. Бенберин
Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии, Санкт-Петербург, Россия
S. I. Tarnovskaya, V. V. Benberin
Saint-Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, St. Petersburg, Russia
© С. И. Тарновская, В. В. Бенберин, 2013 г.
Частота встречаемости сахарного диабета 2-го типа и хронического панкреатита неуклонно возрастает [1]. Причиной ассоциированного с возрастом развития сахарного диабета 2-го типа и хронического панкреатита является уменьшение численности ацинарных и островковых клеток поджелудочной железы. На субклеточном уровне патология поджелудочной железы во многом обусловлена нарушением экспрессии транскрипционных факторов, регулирующих дифференцировку клеток поджелудочной железы. Важнейшими факторами дифференцировки клеток поджелудочной железы являются Ptf1a, Ngn3, Pdx1, Pax6, Foxa2, Nkx2.2 и Pax4 [2, 3]. Белок Pdx1 регулирует пролиферацию и дифференцировку всех типов клеток поджелудочной железы. Белок Ptf1a участвует в дифференцировке ацинарных клеток поджелудочной железы, а также регулирует экспрессию генов ферментов экзокринных клеток поджелудочной железы, включая эластазу-1 и амилазу. Снижение экспрессии гена Ptf1a наблюдается в опухолевых клетках при раке в поджелудочной железе [2]. Белки Pax6, Foxa2, Nkx2.2 и Pax4 активируют экспрессию генов в инсулин- продуцирующих b-клетках, глюкагонпродуцирующих a-клетках и секретирующих панкреатический полипептид PP-клетках островков Лангерганса [4]. Экспрессия Pax6 и Pax4 также обнаружена в соматостатинсодержащих d-клетках [5]. Известно, что мутации в генах Pax6, Foxa2 и Nkx2.2 являются причиной развития сахарного диабета, вызванного нарушением синтеза инсулина в b-клетках.
В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии синтезирован пептид H-Lys- Glu-Asp-Trp-NH2. В экспериментальных исследованиях на животных и у пожилых больных с сахарным диабетом 2-го типа показано, что тетра- пептид снижает уровень сахара в крови [6]. Установлено, что при aллокcановом сахарном диабете у крыс тетрапептид способствует достоверному снижению уровня глюкозы в крови на 35%, что коррелирует с уменьшением количества летальных исходов. Клинические испытания тетрапептида показали его эффективность у людей, страдающих сахарным диабетом 1-го и 2-го типов [6].
Так, под влиянием тетрапептида у пациентов снижался уровень глюкозы натощак и при стандартном глюкозотолерантном тесте, также было отмечено уменьшение концентрации инсулина в плазме крови и индекса инсулинорезистентности. Кроме того, установлено, что тетрапептид способен проникать в ядро и ядрышко клеток и модулировать действие эндонуклеаз на ДНК [7]. Однако молекулярный механизм его действия до конца не изучен.
Целью исследования явилось изучение молекулярных механизмов действия пептида H-Lys- Glu-Asp-Trp-NH2 на дифференцировку ацинарных и островковых клеток поджелудочной железы при старении.
Материалы и методы. Исследование выполняли на культурах эмбриональных клеток поджелудочной железы MIA PaCa-21 и 14 пассажей, полученных в Институте цитологии РАН (Санкт- Петербург). Первый пассаж расценивали как "молодые", а 14-й пассаж — как "старые" культуры в соответствии с рекомендацией Международной ассоциации исследований клеточных культур (США, Сан-Франциско, 2007). Культуры клеток разделили на 3 группы: в 1-ю группу (контрольную) вводили физиологический раствор, во 2-ю группу добавляли контрольный тетрапептид H-Ala-Glu- Asp-Leu-OH в концентрации 20 нг/мл, а в 3-ю группу — тетрапептид H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 в концентрации 20 нг/мл. Клетки культивировали во флаконах площадью 25 см² ("JetBiofil") в 5 мл ростовой среды при температуре 37 °C в среде ДМЕМ с добавлением L-глутамина ("Билот"), 15% сыворотки плодов коровы SC-BIOL ("Биолот") и 1% раствора пенициллина-стрептомицина. Исходная концентрация клеток составила 106 клеток/мл. Для иммуноцитохимического исследования ис- пользовали первичные моноклональные антитела Rtf1a, Pdx1, Pax6, Foxa2 NKx2.2, Pax4 (1: 50, "Abcam") и вторичные антитела — биотинилиро- ванные антимышиные иммуноглобулины ("Novo- castra"). Пермеабилизацию проводили с примене- нием 0,1% тритона Х100. Визуализацию реакции выполняли с применением пероксидазы хрена и диаминобензидина ("EnVision Detection System", Peroxidase/DAB, Rabbit, Mouse). Оценку результатов иммуноцитохимического окрашивания проводили морфометрическим методом на микроскопе Nikon Eclipse E400 с помощью цифровой каме- ры Nikon DXM1200 и программного обеспечения "Vidеotest Morphology 5.0". В каждом случае анализировали 5 полей зрения при ´200. Площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Концентрацию соответствующих мРНК белков Rtf1a, Pdx1, Pax6, Foxa2 NKx2.2, Pax4 оценивали методом количественного ПЦР- анализа. Статистическую обработку экспериментальных данных выполняли в программе Statistica 7.0. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.
Оптимальные трехмерные структуры тетрапептидов Lys-Glu-Asp-Trp и Ala-Glu-Asp-Leu находили методом конформационного поиска молекулярной динамикой в силовом поле Amber12: EHT [8]. Влияние растворителя учитывали в неявном виде с введением внутренней диэлектрической константы, равной 1, а внешней 80. С конформерами, полученными методом конформационного поиска, в дальнейшем проводился докинг с ДНК. При построении молекулы двухцепочечной ДНК учитывалась В-форма молекулы со стандартными большой (2,1 нм) и малой (1,1 нм) бороздками. Выбирались следующие последовательности: TCTCC, TCCCT, GCCTC, GCCCC, CTCCT, CTCCC, CGGTG, CGCCC, CCTGG, CCTCT, CCCTC, CCAGG, CCAGC, CCACA, CAGGC, CAGCC, AGCTC, AGAAA. После построения молекулы ДНК протонировались при условиях pH 7 и T = 300 K и проводилась оптимизация их геометрии в поле Amber12EHT. Для моделирования комплекса двухцепочечной ДНК с тетрапептидами Lys- Glu-Asp-Trp и Ala-Glu-Asp-Leu использовали метод молекулярного докинга, суть которого со- стояла в подборе оптимальной взаимной ориентации молекул при их связывании и образовании стабильного комплекса. При расчете оптимальных ориентаций тетрапептидов в дуплексе ДНК учитывали площадь контакта, количество водородных связей, параметры гидрофобных и электростатических взаимодействий. В качестве сайта связывания выбиралась вся молекула ДНК. Решения докинга ранжировались по величинам оценочной функции: чем более отрицательно значение оценочной функции, тем сильнее взаимодействие. Выраженность взаимодействия пептида с ДНК определяли величиной отрицательных значений DЕ: чем энергия более отрицательна, тем сильнее взаимодействие.
Результаты и обсуждение. При старении культуры клеток поджелудочной железы наблюдалось значительное снижение экспрессии важных для поддержания функциональной активности панкреатических клеток сигнальных молекул. Так, при старении культуры экспрессия факторов дифференцировки Ptf1a и Pdx1, регулирующих развитие клеток — предшественников всех ацинарных и островковых клеток поджелудочной железы, снижалась на 80 и 63%. Такие изменения могут вызвать нарушения экзокринной и эндокринной функций поджелудочной железы и развитие хронического панкреатита и сахарного диабета. Введение пептида H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 увеличивало экспрессию белков Ptf1a и Pdx1 в клетке, восстанавливая их до уровня в "молодых" культурах. В созревании a-, b-, d- и РР-клеток поджелудочной железы участвуют факторы дифференцировки Pax6, Foxa2, Nkx2.2. Их экситепрессия при старении снижалась на 50, 70 и 74% соответственно. При введении пептида значимый эффект наблюдался для фактора дифференцировки a-клеток Pax6: пептид восстановил его уровень в клетке до "молодых" культур. Пептид также стимулировал экспрессию белка Foxa2, однако не восстановил ее до нормы. Экспрессия белка Pax4, секретируемого предшественниками d-клеток и b-клеток, при старении культур и введении пептида H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 практически не изменялась. Следовательно, пептид H-Lys- Glu-Asp-Trp-NH2 способствовал разнонаправленной дифференцировке клеток поджелудочной железы. Методом количественной полимеразной цепной реакции было показано, что увеличение экспрессии вышеперечисленных белков при введении пептида H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 корреллирует с увеличением их матричной РНК в клетке. Это указывает на эпигенетический механизм действия пептида. Скорее всего, пептид подобно транскрипционным факторам, связывается с промоторными участками специфических генов и запускает их экспрессию.
Исследованы конформационные особенности пептида H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 и контрольного пептида H-Ala-Glu-Asp-Leu-OH. Оказалось, что у пептида H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 существует 14 энергетически выгодных конформаций, а у контрольного пептида — 160 конформаций. Все найденные конформации пептида H-Lys-Glu-Asp- Trp-NH2 имеют похожую трехмерную структуру и образуют пи-катионные взаимодействия ин- дольных колец триптофана и аминогрупп лизина. Показано, что пи-катионная связь стабилизирует пространственную структуру пептида H-Lys- Glu-Asp-Trp-NH2. Контрольный пептид H-Ala-Glu-Asp-Leu-OH более лабильный. Наличие положительных и отрицательных областей в молекуле пептида H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 придает ей свойства диполя. Предполагается, что биологический эффект пептида H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 реализуется через связывание с участками генов. Проведенный анализ конформаций пептидов H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 и H-Ala-Glu-Asp-Leu- OH позволил создать модели взаимодействия пептидов с участками ДНК. В промоторных областях генов факторов дифференцировки клеток поджелудочной железы обнаружено 18 схожих последовательностей нуклеотидов длиной 5 п. н. Результаты докинга пептидов с этими последовательностями нуклеотидов показали, что пептид H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 на 1−2 ккал/моль обра- зует более устойчивые комплексы, чем пептид H-Ala-Glu-Asp-Leu-OH. Взаимодействие пептидов H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 и H-Ala-Glu-Asp- Leu-OH c нуклеотидами осуществлялось за счет вандерваальсовых электростатических взаимодействий и образования водородных связей между функциональными группами обеих моле- кул. Оказалось, что пептиды не интеркалируют в азотистые основания ДНК, не разрушая ее вторичную структуру. Пептиды взаимодействуют с большой бороздкой ДНК по нескольким положениям: N7 гуанина, N6 аденина, C5 тимина и N4 цитозина. Полученные в результате молекулярного моделирования структурные модели и вы- явленные особенности взаимодействия пептидов с азотистыми основаниями последовательностей нуклеотидов подтверждают ранее выдвинутые предположения о возможности и характере образования комплексов пептидов с нуклеиновыми кислотами [9].